Rendimiento analítico del microvolumen de ácido nucleico. Cuantificación usando el espectrofotómetro Epoch.
Resumen
Los ácidos nucleicos como el ADN y el ARN se derivan de una variedad de fuentes biológicas para su uso potencial en aplicaciones posteriores. Como la secuenciación y el análisis de la expresión génica. Esta nota de aplicación demuestra el rendimiento analítico del espectrofotómetro Agilent BioTek Epoch y, en especial, la placa multivolumen Agilent BioTek Take3 con respecto al rango dinámico lineal, el límite de detección, la precisión y la exactitud utilizando muestras de microvolúmenes para verificar su amplia aplicabilidad a la cuantificación de ácidos nucleicos. Los datos comparativos se derivaron de los espectrofotómetros Epoch y un NanoDrop; se demostró que el rendimiento era equivalente.
Introducción
La determinación precisa de las concentraciones moleculares es un requisito previo para el uso de ácidos nucleicos purificados para una multitud de aplicaciones posteriores. La cuantificación se realiza de forma rutinaria mediante análisis espectrofotométrico a 260 nm para ácidos nucleicos en un recipiente transparente UV. Históricamente, las mediciones se realizaban con cubetas de cuarzo que tienen un paso óptico fijo de 1 cm y, por lo general, se asocian con mediciones precisas y de alta precisión. El espectrofotómetro Epoch es capaz de medir con precisión hasta 16 muestras con volúmenes tan bajos como 2 μL (Figura 1) utilizando la placa multivolumen Take3.
La placa Take3 proporciona un paso óptico nominal de 0,5 mm que permite la medición en una amplia gama de concentraciones. Las concentraciones se pueden medir a partir de muestras diluidas, bajas en ng/μL, así como muestras en el rango de 1000 ng/μL. Este amplio rango de concentración es típico de los rendimientos de los métodos de aislamiento nucleico actuales: el rendimiento depende del tipo de muestra, el tamaño y el tipo de ácido nucleico que se está aislando. La placa Take3 también es capaz de acomodar dos Agilent BioTek BioCells y una cubeta estándar, lo que amplía el rango de concentraciones cuantificables de la muestra a menos de ng/μl mediante la extensión del paso óptico a 1 cm.
Figura 1. (A) Placa multivolumen Agilent BioTek Take3 mostrada con BioCell colocado. Hay dos ubicaciones adicionales disponibles para un segundo BioCell y una cubeta estándar. Los volúmenes de muestra tan bajos como 2 μL se pueden cargar en 16 ubicaciones de microspot usando una pipeta de un solo canal o multicanal.
Resultados y discusión
Rango dinámico lineal y precisión
dsADN
Los estándares de dsDNA de esperma de arenque se prepararon como una serie de diluciones en serie 1:2 de 12 puntos que dieron como resultado concentraciones que oscilaron entre ~ 4 y 3000 ng / μL. Las mediciones de microvolúmenes con Take3 y NanoDrop se compararon con las tomadas con BioCell colocado en la placa Take3 y se leyeron en el lector de microplacas Epoch y aparecen en la Figura 2. Es evidente que el rango dinámico lineal del espectrofotómetro Epoch para el análisis de microvolúmenes es tres órdenes de magnitud, lo que cubre adecuadamente los rangos de rendimiento y concentración de la mayoría de los kits de aislamiento de ADN (Tabla 1).
Regresión Lineal
También se realizó un análisis de regresión lineal en los datos presentados en la Figura 2. Ambas determinaciones de microvolumen demostraron correlaciones de línea recta casi perfectas (R2 ≥0,9998) y pendientes de 1,020 y 0,967 para el espectrofotómetro Epoch y NanoDrop, respectivamente. La pendiente se puede utilizar como una medida de precisión en relación con las mediciones de 1 cm de longitud de trayectoria en el rango [DNA] presentado en la Figura 2. Por lo tanto, el espectrofotómetro Epoch muestra una diferencia porcentual promedio del 2,0 % en relación con las determinaciones de 1 cm de longitud de trayectoria en tres órdenes de magnitud. [ADN]; NanoDrop, 3,3%.
Tabla 1. [ADN] esperado en aislado de algunos kits de aislamiento de ADN disponibles en el mercado de uso común. Los rendimientos se proporcionan como resultados esperados de la literatura del producto del proveedor.
Figura 2. Curva estándar de dsDNA utilizando diluciones de una muestra de esperma de arenque purificado. Los datos de la abscisa se consideran reales [dsDNA] ya que las mediciones se realizaron con un paso óptico de 1 cm utilizando BioCell. Los datos de ordenadas son determinaciones de microvolúmenes utilizando un espectrofotómetro Agilent BioTek Epoch y NanoDrop. La línea recta pasa por el origen y tiene una pendiente de 1.000, lo que se considera una equivalencia perfecta entre los datos de microvolumen y BioCell. El recuadro es una vista ampliada de bajas concentraciones de dsDNA.
ARN
Los estándares de ARN de levadura se prepararon como series de dilución en serie 1:2 de 10 puntos que dieron como resultado un rango de concentración de ~4 a 2400 ng/μL. Las mediciones de microvolúmenes con el espectrofotómetro Epoch y NanoDrop se compararon con las tomadas con el BioCell colocado en la placa multivolumen Take3 y se leyeron en el lector de microplacas Epoch (Figura 3). Es evidente que el rango dinámico lineal del sistema de espectrofotómetro Epoch es de tres órdenes de magnitud, lo que cubre el rendimiento y la concentración de la mayoría de los kits de aislamiento de ARN (Tabla 2).
Tabla 2. [ARN] esperado en aislado de algunos kits de aislamiento de ADN disponibles en el mercado de uso común. Los rendimientos de ARN de muestras de tejido comienzan con ~25 mg de material; Se usaron 106 células HeLa para generar 20 μg de ARN. Los rendimientos se proporcionan como resultados esperados de la literatura del producto del proveedor.
Regresión Lineal
También se realizó un análisis de regresión lineal en los datos de la curva estándar de ARN presentados en la Figura 3. Ambas determinaciones de microvolumen demostraron correlaciones de línea recta perfectas con 4 decimales (R2 = 1,0000) y pendientes de 0,9900 y 0,9975 para el espectrofotómetro Epoch y NanoDrop, respectivamente. Por lo tanto, el espectrofotómetro Epoch muestra una precisión promedio de 1,0 % en relación con determinaciones de longitud de trayecto de 1 cm en tres órdenes de magnitud [ARN]; NanoDrop, 0,25%.
Figura 3. Curva estándar de ARN utilizando diluciones de una muestra de ARN de levadura purificada. Los datos de la abscisa se consideran [ARN] reales, ya que las mediciones se realizaron con un paso óptico de 1 cm utilizando BioCell. Los datos de ordenadas son determinaciones de microvolúmenes utilizando un espectrofotómetro Agilent BioTek Epoch y NanoDrop. La línea recta pasa por el origen y tiene una pendiente de 1.000, lo que se considera una equivalencia perfecta entre los datos de microvolumen y BioCell. El recuadro es una vista ampliada de bajas concentraciones de ARN.
Precisión
Es evidente a partir de las Tablas 1 y 2 que la concentración de ácido nucleico aislado variará en más de dos órdenes de magnitud según el tipo de muestra, la cantidad, el volumen de elución elegido, el ácido nucleico a aislar y el kit de aislamiento utilizado. La precisión de la cuantificación puede diferir en un rango dinámico tan grande de concentraciones. Las Figuras 4 y 5 demuestran la precisión de las mediciones repetidas de dsDNA de la Figura 2 y ARN de la Figura 3 respectivamente, que abarcan el rango de concentración representado en las Tablas 1 y 2. Es evidente que incluso a una baja concentración de ácido nucleico, la precisión es ≤2,5% CV y promedios ≤1.5% CV, adecuado para una cuantificación precisa.
Figura 4. Mediciones de precisión expresadas cómo %CV de cada uno de los 16 microspots individuales en concentraciones de dsDNA determinadas por BioCell. (A) 35,7 ng/μL; (B) 266 ng/μL; (C) 1050 ng/μl.
Figura 5. Mediciones de precisión expresadas como %CV de cada uno de los 16 micropuntos individuales en concentraciones de ARN determinadas por BioCell. (D) 38,2 ng/μL; (E) 304 ng/μL; (F) 1220 ng/μL.
Límite de detección
La Tabla 3 muestra la magnitud de la desviación estándar para cada micropunto en la placa Take 3. Todas las señales de ruido están por debajo de 0,001 OD. La señal de absorbancia representativa del límite de detección se puede calcular a partir de la desviación estándar promedio de los 16 micropuntos multiplicada por un factor de tres. Este límite de detección es 0.0011 OD.
Tabla 3. Desviación estándar en la señal del blanco para cada uno de los 16 microspots de la placa Take3. Estos datos multiplicados por un factor de tres son representativos de una absorbancia equivalente al límite de detección para cada uno de los 16 micropuntos.
El límite de detección tanto para dsDNA como para RNA se puede calcular a partir de los datos generados para las determinaciones del rango dinámico lineal junto con este límite de detección expresado como una señal de absorbancia. Se determinó que la concentración más baja de ADN de esperma de arenque utilizada en la curva estándar era de 4,7 ng/μL mediante el uso de BioCell de 1 cm de paso óptico; para el ARN, fue de 4,3 ng/μL. Se determinó que la señal de absorbancia corregida de fondo promedio generada por los 16 micropuntos era 0,0042 OD para dsDNA; para el ARN, fue de 0,0053 DO. Por lo tanto, los límites de detección para dsDNA y RNA son 1,2 y 0,90 ng/μL, respectivamente.
Conclusión
El rendimiento analítico del espectrofotómetro Agilent BioTek Epoch se caracteriza por un límite de detección de 1 ng/μl para la determinación espectrofotométrica de microvolúmenes de ácidos nucleicos a 260 nm. El rango dinámico lineal para dsDNA y RNA se extiende más de tres órdenes de magnitud más allá de esto a más de 2500 ng/μL. La precisión relativa a las determinaciones de longitud de trayectoria de 1 cm con Agilent BioTek BioCells muestra una diferencia porcentual de ≤2,0 % en todos los rangos de concentración de dsDNA y RNA.
La precisión sobre esta concentración fue típicamente inferior al 1 % de CV, pero no superior al 2,5 % de CV a concentraciones bajas de ácido nucleico. Este amplio rango de concentración es típico de los rendimientos de los métodos actuales de aislamiento de ácidos nucleicos, por lo que la buena linealidad y precisión en este rango demuestra una amplia aplicabilidad a la cuantificación de ácidos nucleicos. Se observó un rendimiento equivalente entre las determinaciones de microvolúmenes con el espectrofotómetro Epoch y NanoDrop.
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