La degradación de proteínas dirigida de las proteínas que causan enfermedades ha demostrado ser un enfoque terapéutico poderoso.
Resumen
La degradación de proteínas dirigida de las proteínas que causan enfermedades ha demostrado ser un enfoque terapéutico poderoso. La capacidad de monitorear la especificidad de la degradación entre las clases objetivo relacionadas a niveles de proteína endógena, de forma continua en células vivas, es fundamental para comprender la eficacia y el mecanismo de estos compuestos. Esta nota de aplicación muestra la automatización de la degradación paralela y la detección de viabilidad de varios objetivos adhesivos moleculares de fármacos inmunomoduladores (IMiD), IKZF1 (Ikaros), GSPT1 e IKZF2 (Helios) con varios IMiD que utilizan la tecnología Promega Nano-Glo HiBiT, junto con con la incubadora automática Agilent BioTek BioSpa 8 y el lector multimodo híbrido Agilent BioTek Synergy Neo2 .
Introducción
La degradación de proteínas dirigida de las proteínas que causan enfermedades ha demostrado ser un enfoque terapéutico poderoso, particularmente en el campo de la oncología, utilizando IMiD de molécula pequeña, denominados “pegamentos moleculares”. 1-4 La talidomida representa el primer compuesto de esta clase molecular. Se desarrolló por primera vez en la década de 1950 como antiemético, pero se descubrió que era teratogénico y posteriormente se retiró del mercado. Las propiedades teratogénicas de la talidomida estimularon la exploración de sus propiedades anticancerígenas. Se identificó que el principal objetivo celular de la talidomida era cereblon (CRBN), un receptor de sustrato de cullin-RING ligasa 4 (CRL4). 5Los IMiD se dirigen al complejo de ligasa CUL4-RBX1-DDB1-CRBN (CRL4CRBN) E3 para inducir la ubiquitinación y la degradación proteasomal de las proteínas con dedos de zinc de la familia Ikaros (familia IKZF), Ikaros (IKZF1) y Aiolos (IKZF3), que son los factores de transcripción linfoide esenciales para la supervivencia de las células de mieloma. 6,7,8 Los IMiD, como la talidomida, contienen un anillo de glutarimida conservado y un anillo de ftaloílo variable. El anillo de glutarimida interactúa con un bolsillo hidrofóbico conservado de CRBN. 9-11Desde entonces, se han desarrollado varios derivados para mejorar la eficacia. La capacidad de controlar la especificidad de la degradación entre clases de objetivos relacionadas, así como los niveles de proteína endógena de forma continua en células vivas, es fundamental para comprender la eficacia y el mecanismo de los compuestos terapéuticos. La aplicación del etiquetado endógeno HiBiT CRISPR proporciona un enfoque altamente sensible y cuantitativo para la detección de proteínas endógenas en células vivas en una amplia variedad de tipos y líneas de células. 12-14 La alta sensibilidad y las capacidades cuantitativas de HiBiT permiten una fácil implementación de esta tecnología en plataformas HTS para la identificación de nuevos degradadores basados en moléculas pequeñas, como PROTACS y pegamentos moleculares. 15,16Además, la multiplexación en el mismo pozo de los ensayos de salud celular puede proporcionar información adicional sobre cómo estos compuestos están afectando la viabilidad celular. Esta nota de aplicación muestra la degradación paralela y el análisis de viabilidad de varias dianas adhesivas moleculares IMiD clave, IKZF1 (Ikaros), GSPT1 (transición de fase 1 de G1 a S) e IKZF2 (Helios) con varios fármacos IMiD, usando la instrumentación BioSpa y Synergy Neo2.
Experimental
Tecnología Nano-Glo HiBiT
Nano-Glo HiBiT de Promega Corporation (Madison, WI) ofrece un enfoque rápido y altamente sensible para marcar y detectar proteínas endógenas en una amplia variedad de tipos de células y líneas celulares. Este sistema informador se basa en NanoLuc dividido y comprende un péptido de 11 aminoácidos (HiBiT) que se une con una afinidad muy alta a un polipéptido de 18 kDa (LgBiT). La formación eficiente de un complejo brillante y luminiscente permite un análisis altamente sensible y cuantitativo de las proteínas marcadas con HiBiT.17 El pequeño tamaño de HiBiT lo convierte en una excelente opción para el marcado altamente eficiente y discreto de proteínas endógenas mediante la reparación dirigida por homología mediada por Cas9 utilizando monocatenario. plantillas de oligonucleótidos donantes (ssODN). La detección rápida y escalable de proteínas etiquetadas con HiBiT en lisados celulares se puede realizar mediante la adición de proteína LgBiT y sustrato en un tampón de lisis. Alternativamente, la coexpresión de LgBiT permite la detección en células vivas para el análisis en tiempo real de los cambios en la abundancia de proteínas durante períodos prolongados, especialmente cuando se combina con sustratos de células vivas extendidas como Nano-Glo Endurazina, como se ve en la Figura 1. El alto La sensibilidad de HiBiT, combinada con modalidades de detección flexibles, hacen de HiBiT la herramienta ideal para investigar la degradación dirigida como enfoque terapéutico. Además, la simplicidad de la detección de luminiscencia permite una fácil implementación de HiBiT en plataformas HTS para la identificación de nuevos degradadores basados en moléculas pequeñas, como PROTACS y pegamentos moleculares. La coexpresión de LgBiT permite la detección en células vivas para el análisis en tiempo real de los cambios en la abundancia de proteínas durante períodos prolongados, especialmente cuando se combina con sustratos de células vivas extendidas como Nano-Glo Endurazina, como se ve en la Figura 1. La alta sensibilidad de HiBiT, combinado con modalidades de detección flexibles, hacen de HiBiT la herramienta ideal para investigar la degradación dirigida como enfoque terapéutico. Además, la simplicidad de la detección de luminiscencia permite una fácil implementación de HiBiT en plataformas HTS para la identificación de nuevos degradadores basados en moléculas pequeñas, como PROTACS y pegamentos moleculares. La coexpresión de LgBiT permite la detección en células vivas para el análisis en tiempo real de los cambios en la abundancia de proteínas durante períodos prolongados, especialmente cuando se combina con sustratos de células vivas extendidas como Nano-Glo Endurazina, como se ve en la Figura 1. La alta sensibilidad de HiBiT, combinado con modalidades de detección flexibles, hacen de HiBiT la herramienta ideal para investigar la degradación dirigida como enfoque terapéutico. Además, la simplicidad de la detección de luminiscencia permite una fácil implementación de HiBiT en plataformas HTS para la identificación de nuevos degradadores basados en moléculas pequeñas, como PROTACS y pegamentos moleculares. combinado con modalidades de detección flexibles, hacen de HiBiT la herramienta ideal para investigar la degradación dirigida como enfoque terapéutico. Además, la simplicidad de la detección de luminiscencia permite una fácil implementación de HiBiT en plataformas HTS para la identificación de nuevos degradadores basados en moléculas pequeñas, como PROTACS y pegamentos moleculares. combinado con modalidades de detección flexibles, hacen de HiBiT la herramienta ideal para investigar la degradación dirigida como enfoque terapéutico. Además, la simplicidad de la detección de luminiscencia permite una fácil implementación de HiBiT en plataformas HTS para la identificación de nuevos degradadores basados en moléculas pequeñas, como PROTACS y pegamentos moleculares.15,16
Figura 1. Tecnología de etiquetado de proteínas HiBiT. El locus genómico que codifica la proteína de interés puede etiquetarse mediante reparación dirigida por homología utilizando la ribonucleoproteína Cas9 (RNP) en combinación con una plantilla de reparación ssODN. La proteína etiquetada se puede detectar en un ensayo de punto final lítico o coexpresando LgBiT en células vivas.
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