Detecte eficientemente los inhibidores de la actividad de MT1-MMP y la invasión tumoroide de glioma 3D
Autores : Brad Larson, Agilent Technologies, Inc.; Ania Knapinska y Gary Drotlef, Instituto para la Salud Humana y la Intervención de Enfermedades (I-HEALTH), Florida Atlantic University Alphazyme; Gregg Fields, Instituto para la Salud Humana y la Intervención de Enfermedades (I-HEALTH) Florida Atlantic University Departamento de Química, Instituto de Investigación Scripps, Scripps Florida
Resumen
Los gliomas malignos son los tumores cerebrales primarios más comunes en los Estados Unidos. Se ha demostrado que la metaloproteinasa de matriz tipo 1 de membrana (MT1-MMP) es crucial para la progresión, invasión, migración y angiogénesis de los tumores. El uso de un sustrato fluorescente para cuantificar la actividad de MT1-MMP, donde los tumoroides están incrustados en un hidrogel de colágeno, simplificaría la detección de posibles inhibidores de la proteasa, mientras se usa un modelo celular similar a in vivo . Cuando el sustrato y la configuración experimental se combinan con el proceso de imagen y lectura de unión de selección de golpe disponible en el software de lector de microplacas e imagen Agilent BioTek Gen5 , se crea el método de detección de inhibidores más eficiente. Ahorra tiempo y necesidades de almacenamiento de imágenes al generar imágenes de pocillos únicamente con moléculas de prueba que demuestran efectos inhibitorios.
Introducción
Los tumores cerebrales malignos y no malignos se componen de un grupo de más de 100 tipos diferentes. Los gliomas malignos, incluidos el glioblastoma multiforme (GBM) y los astrocitomas, son los tumores cerebrales primarios más comunes en los Estados Unidos 1 y constituyen el 78 % de los tumores cerebrales malignos. 2 Aunque son relativamente raros, particularmente en los EE. UU., los tumores cerebrales malignos exhiben una mortalidad por cáncer desproporcionada debido a sus altas tasas de mortalidad; donde, en promedio, solo un tercio de las personas sobrevive al menos cinco años después del diagnóstico. Se ha demostrado que 3 MT1-MMP (también conocida como MMP-14) es crucial para la progresión, invasión, migración y angiogénesis de los tumores. 4,5MT1-MMP pertenece a un subconjunto de MMP ancladas a la membrana dependientes de zinc, que pueden degradar la membrana basal y las proteínas de la matriz extracelular (ECM) 6 , las moléculas de adhesión celular, las citocinas, los factores de crecimiento y los receptores. 7 Su expresión también se correlaciona con el grado del tumor y se asocia con una supervivencia reducida en los gliomas. 8,9 Por lo tanto, muchos estudios han destacado su potencial como diana terapéutica en muchos tipos de cáncer. 10,11
La invasión se considera una de las principales características del cáncer 12,13 y es el resultado de la interacción continua entre las células tumorales y el microambiente circundante. 12-14Cuando las células de glioma invaden el parénquima cerebral, establecen contacto con las moléculas de la MEC y los componentes de la membrana basal. Como parte de este proceso, las proteasas de superficie, como las MT-MMP, se reclutan en los contactos focales con la MEC donde, directa o indirectamente (a través de la activación de metaloproteasas de matriz soluble), degradan y remodelan la MEC circundante, favoreciendo la invasión. . 15 Durante muchos años, el modelo más simple para estudiar la motilidad celular, especialmente con respecto a las interacciones entre la célula y la MEC, consistía en cultivar células en una monocapa bidimensional (2D) sobre portaobjetos de vidrio, plástico o microplacas. Se utilizaron 16 componentes de ECM como recubrimiento o solubilizados en el medio, y el ensayo implicó la observación de la motilidad. dieciséisA pesar de la sencillez del modelo, existían numerosas limitaciones 16 ; en particular, el ensayo controló la motilidad y no la invasión. 17 Tampoco tuvo en cuenta el hecho de que las células en monocapas se comportan de manera diferente a las células cultivadas en forma tridimensional (3D). 18, 19 Debido a esta limitación, se han desarrollado modelos de células más nuevos y avanzados para imitar mejor el in vivoentorno celular. Un modelo particular que se muestra prometedor incorpora microplacas de esferoides de fondo redondo, donde se agregan células primarias específicas del tumor o líneas de células cultivadas a los pocillos de la placa. Después de la agregación, los modelos tumorales 3D se incrustan en un hidrogel, como colágeno o Matrigel, y se les permite invadir la MEC. Este tipo de modelo permite un desarrollo complejo, que imita más de cerca el desarrollo tumoral 20 y da lugar a tumores que se asemejan al patrón de invasión in vivo del tumor de origen. 20 También se ha demostrado que este modelo de invasión 3D conduce a una mayor producción de enzimas que degradan la matriz, como las metaloproteinasas de matriz 21, 22 , y es más predictivo de la respuesta a la terapia. 23
Se ha demostrado que la incorporación de modelos de células 3D ofrece resultados más indicativos de un in vivorespuesta. Sin embargo, cuando se incluyen imágenes celulares para determinar el efecto de las posibles moléculas de prueba, esto puede conducir a mayores tiempos para la captura de imágenes. Esto se debe a que los invadopodios que se extienden alejándose de la estructura tumoroide original ahora invaden los ejes x, y y z. Por lo tanto, las imágenes deben capturarse en múltiples planos z para visualizar con precisión la invasión. Aumentar la cantidad de imágenes capturadas, necesariamente, también aumenta el tiempo para capturar el conjunto de imágenes y puede aumentar drásticamente el espacio en el disco duro, la red o la nube requerido para almacenar las imágenes. Para resolver este problema, es deseable un método para seleccionar pocillos que contengan moléculas de prueba y el modelo celular 3D de una manera rápida, con menores necesidades de almacenamiento. Esta nota de aplicación describe un método de “selección de aciertos” en el que la señal fluorescente de los pocillos de prueba se comparó con la señal de los pocillos de control positivo sin tratar, con el fin de activar la obtención de imágenes celulares de los pocillos de prueba de “acierto”. Se desarrolló un sustrato FAM-fTHP-9 para este propósito. FAM-fTHP-9 es un sustrato de péptido de triple hélice sintético modelo de colágeno marcado con fluorescencia diseñado para ser dirigido y degradado preferentemente por MT1-MMP.La actividad de la colagenasa 24 MT1-MMP conduce a la escisión del sustrato y a un aumento de la señal fluorescente, detectada por las capacidades de lectura de placas del lector multimodo de imágenes celulares Agilent BioTek Cytation 5.
En el presente estudio, se formaron múltiples líneas celulares de glioma en esferoides tumorales, seguido de la adición de colágeno tipo I. A continuación, se añadieron a los pocillos muchos inhibidores de MT1-MMP conocidos para inhibir potencialmente la invasión de los modelos celulares 3D. Durante el procedimiento, se leyeron todos los pocillos de control y de prueba, y se cuantificó la señal del sustrato cortado. La invasión desinhibida dentro de los pocillos de control positivo exhibió altos valores de fluorescencia. Por lo tanto, se estableció un criterio de selección de aciertos: se tomaron imágenes de todos los pocillos que contenían moléculas de prueba que eran estadísticamente más bajas que el promedio en la señal fluorescente del control positivo correspondiente, que debería mostrar una invasión inhibida. No se tomaron imágenes de los pozos que no eran significativamente más bajos. El resultado fue un método robusto y fácil de realizar para reducir el tiempo de captura de imágenes y los requisitos de almacenamiento.
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